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石墨烯距离生医商品化的时间还有多久?(2╱5) – 感测篇

文章来源:unima新材网  2016-03-14

标签:石墨烯生物医学感测

回想从事石墨烯产业三年多以来,一开始并不是看到那么宽广的未来,对于石墨烯的用途总是有那么多的不确定感。随着经验与知识的增加,进而改变外界对石墨烯的偏误信息后,终于找到石墨烯该有的方向,并据此屡屡创造新的惊奇,如果读者有一直阅读我的文章,应该可以体会我现在的感受。

这是个责任,也是个沉重的负担。回想近日我与中国某石墨烯概念股上市公司总监谈到合作石墨烯平台乙事,她的看法是国内石墨烯产业现今还不成局,建立产业园的时机太早,要几年才有可能。我反而好奇志阳已经创造了世界第一,但连上市公司都不愿真正参与石墨烯先期的投入,只想等成果还坐享其成,何来的企业创新转型?何来的中国制造 2025?他们不做,我义无反顾。

石墨烯不断地在各种领域上证明其价值,我从来没有看过有任何一种材料可以横跨哪么多的应用领域。这篇文章我们来谈谈生医领域的感测及成像,除了前一篇的抗菌篇外,加上后面三篇谈到光热、药物载体及基因,连贯成整个石墨烯在生医领域的布局。

生医感测

感测技术的核心在「表面增强拉曼光谱」的应用。表面增强拉曼光谱 (SERS) 是一种利用表面电磁场增强提高拉曼信号的分析技术。与红外 (IR)、紫外 (UV)、核磁共振 (NMR)、荧光、x 射线衍射 (XRD) 等光学分析手段相比,具有很多突出优势。表面增强拉曼检测限非常低,可用于痕量分析,甚至可以实现目标检测物的单分子检测;分析过程只需要数毫秒到数十秒不等,可实现对被分析物快速检测和实时信息反馈;能够提供丰富的指纹图谱信息而具有较高的分析准确性;水分子的拉曼响应较弱,因此适用于含水样本的分析,尤其是生物样本,无需复杂的前处理即可检测;与其他分析方法如 IR、核磁共振等相比,对样本纯度要求低,可大大减少样本前处理工作并节约分析成本;拉曼检测所需样本量极少,且为非入侵破坏性检测,可为目标检测物的后续分析提供方便。

表面增强拉曼散射 (SERS) 光谱作为一种高灵敏信号检测和具有单分子识别功能的光谱技术,在分析化学、生物医学等领域有着重要的应用。目前,SERS 增强机理主要有「电磁场增强」和「化学增强」两种。电磁场增强机理与金属表面产生的「表面等离激元」有关,表面等离激元的共振依赖于纳米材料的形貌、结构、组分、耦合情况等,可使得吸附到粗糙金属表面的探针分子的拉曼信号增加 10E3—10E8 倍。SERS 技术逐渐成为表面科学和电化学领域有力的研究手段,并已在痕量分析乃至单分子检测、化学及工业、环境科学、生物医学体系、纳米材料以及传感器等方面的研究巾得到了广泛应用,甚至出现了拉曼技术与其他技术的联用。

石墨烯是具有二维蜂窝状网络结构的材料,其 sp2 杂化碳原子的 2pz 轨道构成了大的离域键。石墨烯大的表面积和良好的导电性使其有利于吸附更多的探针分子,促进石墨烯与探针分子之间的电荷转移,从而使探针分子的拉曼信号增强 2—17 倍,这种增强机理归之为化学增强机理。最近的研究表明, 将氧化石墨烯或石墨烯与金属纳米材料复合,借助金属等离激元的电磁场增强和石墨烯的化学增强的耦合作用可以极大地提高探针分子的拉曼信号,同时,复合材料的抗氧化性能和生物兼容性也有所提升。

Kim等 (2012) 制备出 GO╱银纳米粒子╱GO 三层复合结构,得到了比单独银纳米结构或者石墨烯更强的拉曼信号,在 72 天后基底依然表现出良好的 SERS 活性 (如图 1)。

 GO╱银纳米粒子╱GO 三层复合结构良好的 SERS 活性

Liu 等 (2012) 采用电化学沉积技术制备的金╱石墨烯╱金复合结构也表现出了优良的 SERS 活性。(如图 2)

 采用电化学沉积技术制备的金╱石墨烯╱金复合结构也表现出了优良的 SERS 活性

汤建 (2014) 通过界面自组装技术在 DLC:P 衬底表面构筑 AuNP╱GO╱AuNP 复合结构,并将 AuNP╱GO╱AuNP 复合结构作为 SERS 活性基底,考察复合结构检测探针分子 RhB 的行为。紧凑排列的椭球形 AuNP 的电磁场增强效应和 GO 的化学增强效应有利于提高复合结构的 SERS 活性,增强探针分子的拉曼信号。AuNP╱GO╱AuNP 复合结构可检测到浓度低至 10 nmol╱L 的 RhB 分子的拉曼信号,且在 10—1000nmol╱L 范围内,拉曼信号强度与浓度有良好的线性关系。不同复合基底表面吸附的 RhB 拉曼光谱如图 3

不同复合基底表面吸附的 RhB 拉曼光谱

这么好用的感测技术我们怎会缺席?何况我们已经积累了三代生物芯片的技术,第一代生物芯片为阳极氧化铝╱银納米数组 SERS芯片,我们以阳极氧化铝(AAO) 当作模版,将银納米粒子镶入阳极氧化铝模版中。(如图 4)

以阳极氧化铝 (AAO) 当作模版,将银納米粒子镶入阳极氧化铝模版中

第二代生物芯片采用胜肽醣(万古霉素)╱银纳米数组SERS芯片 (如图 5),特性为:

(1) 捕捉血液中的细菌,但与血球不反应;

(2) 抗药性细菌之快速检测;

(3) 快速侦测(不需标定荧光物质、不需培养细菌),增快约100倍 (传统:2-5天,新型生物芯片:可望30分钟)。

第二代生物芯片采用胜肽醣(万古霉素)╱银纳米数组SERS芯片

第三代芯片为可挠式具备三维热点之拉曼增强基板,其中 NSP 可用石墨烯取代 (如图 6),其特点为:

(1) 载体具可挠性,增加与生物体接触的面积,进而增加 SERS 效应,可应用在大型及形状不规则之生物体;

(2) 具备三维方向热点 (Hot junctions) 效应,SERS 效应优于传统基板;

(3) 背景讯号微弱,不干扰待测物量测。

第三代芯片为可挠式具备三维热点之拉曼增强基板,其中 NSP 可用石墨烯取代

各位读者可能不知道,病人往生两天后,检验室才通知被极强的抗药性细菌所感染,而直接检测是表面增强拉曼散射最普遍的检测方式,目标分子吸附在金属纳米粒上,即可得到目标分子的指纹图谱,只要数据库建置完整,可望 30 分钟内就知道确切病情。

生医成像

石墨烯量子点由于「边缘效应」和「量子尺寸效应」可表现出独特的光化学特质。石墨烯除了具有碳量子点所具有的优点外,其荧光具有激发波长依赖。当激发波长从 310 nm 变成 380 nm 时,荧光发射峰位置的相应从 450 nm 移至 510 nm,光致发光强度迅速降低。而吴兴龙 (2013)从氧化石墨烯(Graphene Oxide)到还原的氧化石墨烯(reduced Graphene Oxide)的化学还原过程,通过高分辨的透射电子显微镜、拉曼光谱、傅立叶变换的红外光谱等手段研究在还原过程中结构发生的变化,并将这些结构上的变化和荧光光谱的演变联系起来。发现氧化石墨烯主要表现出宽谱的红光发射,主要来源于含氧官能团相关结构。还原后,石墨烯表现出激发光波长依赖的发射波长移动的发光谱,发光波长涵盖从 430 到 650 nm 的范围,强度逐渐减弱。特别要注意的是,蓝光发光强度比其他波长的发光要强得多,并且随着激发光波长从 300 到 350 nm 变化,荧光峰基本不移动,荧光寿命相比长波长的发光要短,这些特征表明:蓝光和长波长的发光起源是不一样的。 (注﹕量子点尺寸越小,其禁带宽度越大,发射波长越短,称为「量子尺寸效应」)

在还原的过程中,石墨烯结构上发生的变化主要有三方面,其一,含氧官能团减少;其二,石墨结构的碳团簇(sp2 C clusters)的形成;其三,由于含氧官能团移除造成的碳空位缺陷。他们提出长波长的发光起源于 sp2 C clusters 的尺寸效应,这与大量的前期研究结果是一致的,而蓝光则其起源于碳空位缺陷,第一性原理的计算也验证了这一结论。(见图 7)

蓝光则其起源于碳空位缺陷

他们还研究了各种化学修饰石墨烯的荧光,发现均表现出相似的规律,发光谱由两部分组成,峰位不移动的蓝光发射和峰位变化的长波长发光。相对于没有进行修饰的石墨烯,长波长发光显著增强。他们提出这是由于嫁接的官能团能够提供新的激发跃迁过程,并且增强原本很弱的 sp2 C clusters 的尺寸效应的激发过程,使得相应的发光过程得到增强。这一结果对于设计和调控石墨烯荧光具有重要的参考价值。

Zhu 等 (2011) 利用水热法制备了量子产率为 11.4% 的绿色荧光 GQDs,并用于骨肉瘤细胞的成像研究 (如图 7)。Peng 等 (2012) 将碳纤维用化学剥离的方法制备 GQDs, 发现随着 GQDs 粒子大小的变化,可以发出蓝、绿两种不同颜色的荧光,并用于乳腺癌细胞的成像研究。但是,制备发射不同荧光的 GQDs,并提高其量子产率仍然面临挑战。

利用水热法制备了量子产率为 11.4% 的绿色荧光 GQDs,并用于骨肉瘤细胞的成像研究

谢文菁 (2012) 利用电化学方法在碱性条件下电解石墨棒,通过常温下水合肼还原,得到 5~10 nm 的荧光石墨烯量子点(Graphene Quantum Dots, GQDs)。图 8 是人体肺癌细胞和人体乳腺癌细胞与 GQDs 共同孵育后,在激发波长为 405 nm 时的激光共聚焦成像图。在该激发波长下,两种肿瘤细胞可以发出亮黄色的荧光,可清晰地看出其细胞形貌,说明 GQDs 很容易进入细胞,并且不附着在细胞表面。(注:人体肺癌细胞 (a)和人体乳腺癌细胞 (b))

人体肺癌细胞和人体乳腺癌细胞与 GQDs 共同孵育后,在激发波长为 405 nm 时的激光共聚焦成像图

图 9 是人体肺癌细胞和人体乳腺癌细胞加入 GQDs 水溶液后的细胞毒性图。当 GQDs 水溶液浓度较低时,两种肿瘤细胞的存活能力变化不大。当把GQDs 水溶液的浓度提高到 50 μg╱mL,人体肺癌细胞的存活率变化不大,而人体乳腺癌细胞的存活能力也仅降至 60%。说明 GQDs 有良好的生物兼容性,表现出较低的细胞毒性。

人体肺癌细胞和人体乳腺癌细胞加入 GQDs 水溶液后的细胞毒性图

最后,我们来谈谈石墨烯的生物危害性。相关的研究倒也不少 (见图 10)。

石墨烯的生物危害性

ZHANG Xiao (2012 ) 采用改进的 Hummers 方法制备了纳米尺度的氧化石墨烯,对氧化石墨烯的表面进行羧基化,并连接上聚乙二醇 (PEG) 使其在细胞培养液中可溶并能稳定保存。体外细胞实验表明PEG修饰的氧化石墨烯在水中具有良好的可溶性,对 A549 细胞没有明显的毒性。Hu 等人 (2010) 比较了石墨烯氧化物和还原型石墨烯氧化物对人肺腺癌细胞A549 的细胞毒性。A549 与浓度为 20 g╱mL GO 纳米片层共孵育24 h 后,细胞活力为80%;当浓度达到 85 g╱mL,细胞活力降至 50%;两种浓度下,GO 只抑制了 A549 细胞增殖,并未诱发细胞凋亡和死亡,呈现了良好的生物兼容性。研究还发现,相同剂量下,rGO 纳米片层对 A549 细胞的毒性高于 GO,这说明石墨烯表面的官能团也会影响到其细胞毒性。

Hu 等 (2011) 进一步研究发现 GO 的细胞毒性表现出明显的浓度依赖性,却不存在时间依赖性。通过研究 GO 对胎牛血清 FBS 的吸附动力学和比较 GO 在有血清和无血清状态下的细胞毒性,他们认为 GO 这种非时间依赖性的毒性可能与 GO 和细胞间相互作用有关。当 GO加入含有血清 FBS 的细胞培养基时,GO 表面会吸附培养基中 FBS 形成蛋白包裹体,进而阻碍了 GO 本身与细胞膜的直接作用,从而降低 GO 的细胞毒性;然而,当 GO 加入无血清的细胞培养基时,GO 与细胞可直接相互作用,引发细胞膜损伤,导致细胞死亡。GO 的这种吸附能力主要与其具有大的比表面积和丰富官能团有关。上述研究说明,石墨烯的氧化程度与尺寸大小直接影响其细胞毒性,而且存在明显的浓度依赖性。不同氧化程度的石墨烯,GO 比 rGO 具有更好的生物相容性。不同尺寸的石墨烯氧化物,细胞毒性随着尺寸的减小而显著降低;GO 的尺寸大于 100 nm 时,只有低于一定浓度才表现出良好的生物相容性。这一个结论在其他研究中也得到了很好的证实。

目前,石墨烯和细胞相互作用的途径和机制尚不清楚。关于摄取机制方面,小片层石墨烯氧化物 (500 nm 以下) 主要通过丝状伪足包裹或网格蛋白介导的内吞作用进去细胞,而大片层石墨烯氧化物 (1~2 μm) 则主要通过吞噬作用进入细胞。毒性机制方面,大多数研究者认为 GO 的细胞毒性主要由氧化应激介导。但也有少数研究认为石墨烯氧化物对细胞的毒性,可能是材料与细胞膜之间相互作用引起的。石墨烯的细胞毒性机制还有待于进一步的研究。

石墨烯及其衍生物的动物毒性是石墨烯生物安全性评估的又一重要指标。Zhang 等 (2011) 用放射性同位素铼 (188R) 示踪 GO,通过尾静脉将188R-GO (1 mg╱kg) 注入小鼠体内,发现GO 主要沉积在小鼠肺部,但网状内皮系统对 GO 的摄取量较少;当 188R-GO 浓度提高到 10 mg╱kg 时,小鼠肺部会出现明显的病理性改变,提示高剂量的 GO 存在肺毒性。Li 等 (2013) 进一步研究了纳米尺寸石墨烯氧化物 (nano-GO, NGO) 对小鼠的毒性作用。研究发现 NGO 处理后的小鼠表现出明显的急性肺损伤和慢性纤维肺;但该损伤在地塞米松的治疗下可以得到缓解,提示 GO 引起的肺毒性可能与氧化应激有关。

石墨烯氧化物诱发动物出现的肺损伤是 GO 动物毒性的主要症状,但修饰后的GO 可以极大地降低该损伤。Duch 等 (2011) 在研究 GO肺毒性的同时将 GO 分散于聚丙乙醇和环氧乙烷加聚物(普朗尼克),发现 GO 诱发的肺毒性被明显减弱。Sahu 等 (2012) 将 GO 用普朗尼克制成水凝胶,皮下注射于小鼠,病理苏木精-伊红染色法 (HE) 结果显示,该材料处理3 周后,注射部位仅显示出轻度炎性反应,8 周后炎性反应消失;注射期间其他部位并未发现明显的炎性、组织坏死等病变。

石墨烯的生物安全性研究已经积累了一定的研究基础,但是由于石墨烯制备方法的多样性和生物系统的复杂性,石墨烯的生物安全性问题仍不能简单归纳得出结论,需要综合多方面的因素进行深入研究。但我们坚信只要防范得宜,避免吸入纳米级造成的肺损伤,就可以好好的应用这个特别的好东西。

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